乳基功能蛋白微生物细胞工厂构建与优化研究进展

刘龙^1,2

¹江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室

²江南大学未来食品科学中心

乳蛋白是乳汁中的关键营养成分，主要由酪蛋白和乳清蛋白组成，能够为婴幼儿提供全部必需和非必需氨基酸。其中，具有特定生理活性的乳蛋白被称为乳基功能蛋白，如乳铁蛋白、骨桥蛋白等，被广泛应用于营养健康与生物医药领域。传统乳基功能蛋白的提取方法受限于原料供应不足、工艺复杂和提取效率低，难以支撑其产业化发展。近年来，微生物凭借其生长迅速，易于遗传操作和适合规模化培养等优势，成为乳基功能蛋白异源生产的重要替代平台（图1）。目前已有多种关键蛋白在大肠杆菌、毕赤酵母等系统中成功表达。该文综述了主要乳基功能蛋白的结构特征及其生物学功能，系统总结了微生物表达体系的优化策略，探讨了当前面临的技术挑战，包括翻译后修饰不完全，分泌效率低和宿主蛋白酶介导的降解等问题。同时，展望了整合人工智能辅助蛋白设计，多组学调控手段以及微流控高通量筛选等前沿技术在优化表达系统中的应用潜力，为乳基功能蛋白的高效、规模化生物制造提供理论依据和技术支持。

近年来，微生物表达系统已发展成为重组酪蛋白生产的核心平台。其中，β-酪蛋白在大肠杆菌和毕赤酵母中已实现表达，其产物功能特性与天然蛋白高度相似。κ-酪蛋白及其活性片段κ-酪蛋白巨肽在酵母和谷氨酸棒杆菌中成功合成，然而，其完整形式的规模化生产仍具挑战。另外，α_s1-酪蛋白在大肠杆菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌中均能实现异源表达（图2）。相比之下，由于α_s2-酪蛋白需要复杂的磷酸化修饰，其在微生物合成尚未取得突破，是未来研究的重点方向。

1.1  β-酪蛋白

传统β-酪蛋白主要依赖从动物乳汁中提取，这种方法不仅产量受限、成本高昂，而且难以实现特定基因型蛋白的规模化制备。相比之下，微生物细胞工厂通过代谢工程改造和发酵工艺优化，能够实现环境友好、可定制化的高效生产，为β-酪蛋白的功能研究和应用开发提供了新思路。目前，大肠杆菌表达系统因操作简便、生长快速等优势，被成功用于β-酪蛋白的异源合成。然而，大肠杆菌缺乏真核生物特有的翻译后修饰能力，限制了其在生产具有完整生物活性的乳蛋白中的应用。相比之下，毕赤酵母表达系统因强大的蛋白分泌能力和翻译后修饰功能而备受关注。尽管如此，当前微生物合成体系的产量和成本仍难以满足工业化需求，未来研究需进一步优化宿主细胞代谢网络，开发高效表达元件，并结合人工智能辅助的蛋白设计，以实现更高产量、更低成本的β-酪蛋白规模化生产。

1.2  κ-酪蛋白

在人体消化过程中，κ-酪蛋白被凝乳酶特异性水解后释放的κ-酪蛋白巨肽（CMP）已成为当前乳源生物活性肽研究的重点。CMP不仅具有促进蛋白质消化吸收的营养功能，还因其显著的抗过敏、抑菌和免疫调节等生物活性而备受关注，在功能性食品和医药领域展现出广阔的应用前景。近年来，研究人员尝试利用多种微生物表达系统进行κ-酪蛋白的异源表达，然而产量表现存在明显差异（表2）。开发高效κ-酪蛋白微生物细胞工厂，突破现有产量瓶颈，仍是该领域亟待解决的问题。

1.3  α_s1-酪蛋白

α_s1-酪蛋白经特异性酶解后产生的多肽能与钙、镁、铁、锌等金属离子形成可溶性复合物，显著提高矿物质的生物利用度，这一特性使其在营养强化和功能性食品领域具有重要应用价值。研究者已在多种微生物宿主中尝试异源表达α_s1-酪蛋白，旨在建立高效可控的蛋白生产平台。未来研究应聚焦于解决大肠杆菌表达系统中的包涵体形成问题。通过优化诱导表达条件（如温度、诱导剂浓度和诱导时间）、共表达分子伴侣系统（如GroEL/GroES和DnaK/DnaJ）以及采用蛋白酶缺陷型宿主菌株改造，可以显著改善重组蛋白的折叠效率并维持其生物活性。同时，通过新型信号肽筛选和分泌途径改造，有望突破现有可溶性表达水平的限制。这些系统性优化手段将为建立基于大肠杆菌的高效α_s1-酪蛋白生产平台提供关键技术支撑。

2.1  β-乳球蛋白

食品工业中，β-乳球蛋白因优异的凝胶性、乳化性和起泡性而被广泛应用于乳制品、蛋白饮料和烘焙食品中，其功能特性受pH值、温度及离子强度等因素调控。此外，β-乳球蛋白因结构明确且易于纯化，常作为结构生物学和蛋白质折叠研究的模型蛋白。近年来，通过微生物细胞工厂重组表达β-乳球蛋白的技术日益成熟，产量显著提升，为乳蛋白的可持续生产提供了新策略。

β-乳球蛋白的生产系统主要包括原核和真核表达体系，不同宿主细胞在表达效率和产物特性上各具特点（表2）。在原核表达系统中，大肠杆菌因快速生长和易于量产的优点而成为常用宿主。此外，干酪乳杆菌也被用于β-乳球蛋白的生产。相比之下，真核表达系统在产量和蛋白正确折叠方面更具优势。酵母细胞因遗传背景清晰、操作简便和安全可靠等特点而成为最具应用潜力的表达系统。总体而言，真核表达系统特别是毕赤酵母和里氏木霉在β-乳球蛋白的工业化生产中展现出巨大应用前景，然而，其结构与功能仍需进一步优化。

2.2  α-乳白蛋白

微生物发酵生产α-乳白蛋白因周期短、成本低和环境友好等优势而成为研究热点（表2）。1988年，科学家首次在大肠杆菌中成功表达山羊源α-乳白蛋白，通过优化表达元件和发酵条件，并经包涵体复性处理后获得1.5 mg/L活性蛋白。近年来，研究者将该基因整合至酿酒酵母表达系统，通过构建含α-乳白蛋白前导序列或α-分泌信号肽的表达框，实现了山羊源和牛源α-乳白蛋白的分泌表达，其中牛源α-乳白蛋白产量提升至2 mg/L。此外，在毕赤酵母表达系统中异源表达山羊源和牛源的α-乳白蛋白时，发现糖基化位点的增加会显著降低α-乳白蛋白分泌量。

相较于动物源α-乳白蛋白，人源α-乳白蛋白不仅具有更高的生物相容性和营养价值，而且能够有效降低过敏风险，在医药和食品领域更具应用潜力。针对人源α-乳白蛋白的重组表达，研究人员首先在枯草芽孢杆菌RIK1285菌株中克隆人源的LALBA基因，并通过组合筛选173种信号肽和3种强启动子提高了表达强度。结果显示，在使用诱导型启动子Pglv时产量可以达到122 μg/mL。在毕赤酵母表达系统中，采用α-信号肽可以使产量提升至56.3 mg/L，并进一步通过工程化内质网和过表达翻译因子等策略，在3 L发酵罐中的产量达到113.4 mg/L。此外，为克服甲醇诱导剂的毒性问题，研究者开发了乙醇诱导系统，结合信号肽及拷贝数优化，最终在3 L发酵罐中的产量达到0.6 g/L，为目前报道最高水平，这为人源α-乳白蛋白的工业化生产奠定了重要基础。

2.3  血清白蛋白

血清白蛋白的传统生产方式主要依赖于从血液中提取、纯化，然而这种方法面临着供需失衡和安全性的双重挑战。一方面，全球市场对血清白蛋白的需求量持续增长，仅靠血液来源难以满足实际需求。另一方面，虽然血液来源的人源血清白蛋白具有较低的免疫原性，但是潜在的血液污染风险始终为悬而未决的安全隐患。因此，采用基因工程技术在微生物系统中进行重组表达，成为突破产量和安全瓶颈的重要方向。1981年研究人员首次成功在大肠杆菌中表达了人源血清白蛋白，然而表达产物以包涵体形式存在，这一技术瓶颈严重限制了其工业化应用。相较于原核表达系统，真核微生物在表达血清白蛋白方面展现出显著优势。研究者们通过多种策略不断优化表达体系，取得了系列突破性进展。

值得注意的是，在血清白蛋白异源表达的研究中，甲醇和抗生素的使用带来的安全隐患一直是亟待解决的关键问题。针对这一挑战，科研人员积极探索更安全的替代表达系统。其中，乳酸克鲁维酵母因天然、不依赖毒性诱导剂的特性成为首选。另外，研究人员建立了一步法无抗性标记的血清白蛋白表达载体的构建技术，消除了抗生素基因可能带来的生物安全风险，也为其它重组蛋白的安全制备提供了创新性解决方案。

2.4  乳铁蛋白

近年来，乳铁蛋白在多种细菌表达系统中实现重组表达（表2）。然而，细菌表达系统存在明显的局限性，特别是缺乏真核特异的翻译后修饰能力，导致重组乳铁蛋白多以无活性的包涵体形式积累，这不仅增加了复性工艺的难度，也可能影响最终产品的生物学功能。酵母作为最常见的真核蛋白表达系统，能够对外源蛋白进行加工折叠和翻译后修饰，已成功用于表达来自于人、牛、山羊、猪和马等多种物种的乳铁蛋白。除此之外，丝状真菌也具有良好的生长特性和分泌大量胞外蛋白的能力，其分泌的蛋白质糖基化模式与酵母所采用的高甘露糖糖基化方式不同，更加接近于哺乳动物。其中，曲霉是表达乳铁蛋白的主要丝状真菌宿主，已在米曲霉、泡盛曲霉和构巢曲霉中成功表达了人乳铁蛋白。

2.5  骨桥蛋白

由于天然骨桥蛋白提取面临来源稀缺、分离纯化困难以及病原体污染风险等问题，因此近年来微生物重组表达骨桥蛋白成为研究热点。不同微生物表达系统在表达效率、翻译后修饰和胞外分泌方面存在显著差异，例如大肠杆菌虽成本较低但缺乏糖基化修饰能力，而以酵母为主的真核微生物虽能够实现近人源化修饰但工艺较为复杂。为了提升骨桥蛋白的产量和功能，筛选微生物底盘细胞和优化分泌表达途径成为关键研究方向。

近年来，乳基功能蛋白的微生物合成体系已取得显著进展。目前主要采用的原核表达系统包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌，其中大肠杆菌表达系统常面临包涵体形成的挑战，而枯草芽孢杆菌因天然分泌能力可有效规避这一问题，然而需进一步优化其信号肽序列以防止表达产物滞留于周质空间。真核表达系统如毕赤酵母和酿酒酵母虽具备完善的翻译后修饰和分泌机制，但在高表达乳基功能蛋白时仍存在明显局限。研究发现哺乳动物特有的糖基化与磷酸化修饰模式与微生物系统存在显著差异，这直接影响表达产物的结构与功能。本团队在毕赤酵母中重组表达乳铁蛋白和骨桥蛋白时发现，大量蛋白异常积累于胞内，这主要归因于错误折叠导致的转运障碍（图3）。针对这一问题，通过上调分子伴侣蛋白表达水平并改造囊泡转运相关基因，可显著改善蛋白的正确折叠效率并促进分泌，这为其它乳基功能蛋白的重组表达提供参考。

蛋白分泌至胞外后的稳定性差是另一个亟待解决的问题。随着发酵时间的延长，目标蛋白的降解现象尤为显著，这可能主要涉及两方面的因素。一方面，异源表达的乳基蛋白可能因未能形成正确的高级结构而在非天然环境中表现出固有的不稳定性，容易发生自发降解。另一方面，宿主菌分泌的胞外蛋白酶系统会进一步加剧这一降解过程。然而，值得注意的是，在毕赤酵母表达系统中，即使通过基因编辑技术敲除已报道的数十种蛋白酶基因，目标蛋白的产量和稳定性仍未得到显著改善。这一现象表明重组乳蛋白降解的主要原因可能并非单纯的蛋白酶作用，而是异源蛋白在宿主细胞环境中无法维持其天然构象所导致的结构不稳定性。未来研究应着重于优化宿主细胞的折叠微环境，通过分子伴侣共表达、培养条件调控等策略来促进异源蛋白的正确折叠。同时，采用蛋白质工程技术对目标蛋白进行理性设计，增强其结构刚性，也是提高胞外稳定性的可行途径。

显然，构建高效生产乳基功能蛋白的微生物细胞工厂需要建立全局优化策略，从基因序列设计到发酵工艺调控进行系统性改造。首先在基因层面，可采用人工智能驱动的蛋白质理性设计技术，通过深度学习算法预测和优化目标蛋白的密码子偏好性、mRNA二级结构及蛋白质折叠路径，从源头上提升表达效率。其次，微流控高通量筛选平台的建立将大幅加速优良表达元件的发掘进程，使启动子、信号肽等调控元件的筛选效率得到数量级提升。此外，结合基因组学、转录组学和蛋白质组学数据，精确解析宿主细胞的代谢网络瓶颈，通过动态调控关键代谢节点实现胞内资源的最优分配。这些前沿技术的协同应用将突破传统试错法的局限，为构建高性能微生物细胞工厂提供全新解决方案，最终实现乳基功能蛋白的工业化高效生产。